Тканевая инженерия клапанов сердца: децеллюляризация

На долю операций по поводу заболеваний клапанного аппарата сердца приходится большая часть всех кардиохирургических вмешательств. Число пациентов, нуждающихся в протезировании клапанов сердца, на 2005 год составляло 290 тысяч человек.

С каждым годом качество, дизайн и свойства протезов становятся все совершеннее, но все равно не могут сравниться по своим свойствам с нативными клапанами. Самые частые осложнения после имплантации механических клапанов — это тромбоэмболии, кровотечения и протезный эндокардит. Биологические клапаны решают осложнения, возникающие с механическими клапанами, но им свойственна кальцификация и биодеградация, которые требуют реоперации через 10-15 дет. Для предотвращения возникновения вышеперечисленных осложнений и приближения к структуре естественных клапанов необходимо прибегнуть к тканевой инженерии.

Микроскопически створки клапана состоят из трех слоев: желудочкового, в составе которого эластиновые волокна, фиброзного, состоящего из коллагеновых волокон, и губчатого слоя, богатого гликозаминогликанами. Коллаген, эластин и гликозаминогликаны образуют ЭЦМ. Коллагеновые волокна не эластичны, имеют складчатую структуру и отвечают за противостояние нагрузкам во время диастолы. Эластиновые волокна восстанавливают сокращенную конфигурацию створок во время систолы. Губчатый же слой абсорбирует и гасит энергию удара струи крови во время систолы.

Клеточный состав включает эндотелиальные клетки (ЭК) и интерстициальные клетки (ИК. ЭК создают атромбогенную поверхность клапана и контролируют воспалительные и иммунные реакции. ИК — гетерогенная группа клеток, осуществляющих синтез компонентов ЭЦМ и его ремоделирование.

Первые попытки создания клапанов с помощью методов тканевой инженерии были предприняты M. Grimm et al. в 1991 году. Группа ученых исследовала рост ЭК на бычьем перикарде, фиксированном в глутаральдегиде.

Классическая технология тканей инженерии включает в себя создание каркасной основы, совмещение ее с клетками, инкубирование материала in-vitro для формирования прототипа ткани. Основными направлениями разработок каркасных основ являются: децеллюляризация тканей, создание синтетических рассасывающихся матриксов и полимеризованных биологических экстрацеллюлярных носителей, содержащих клетки.

Идеей метода децеллюляризации для изготовления клапанов является осознание того, что основную антигенную нагрузку несет клеточный аппарат клапана. Чаще всего имплантируемые ксенографты не соответствуют комплексам гистосовместимости. Кроме того, ксенографты фиксируются в глутаровом альдегиде, который, в свою очередь, является причиной цитотоксичных реакций, кальцификации и деградации.

Основной задачей децеллюляризации является устранение клеток при полном сохранении структуры ЭЦМ. Процесс создания бесклеточного матрикса складывается из этапа разрушения клеточных мембран и рибонуклеиновых кислот и этапа их экстракции при помощи разных детергентов. Чаще всего в качестве детергентов используются анионные, цвиттерионные, неионные вещества, энзимы (трипсин). Энзимы необходимы для расщепления и удаления ДНК и РНК.

Додецилсульфат натрия (SDS) до недавнего времени описывался как эффективный детергент по удалению клеток. Однако в последнее время большинство исследований доказывают дестабилизирующее действие SDS на матрикс: SDS дестабилизирует тройной спиральный домен коллагена и вызывает набухание эластина, разрушая тем самым ЭЦМ. После обработки клапанов SDS повышается их растяжимость, кроме того, после совмещения обработанных SDS створок клапана с ЭК происходит массивный лизис клеток спустя 24 часа после культивирования.

Использование гипо-и гипертонических растворов эффективно удаляет клеточные элементы, но при исследовании с антителами к главному комплексу гистосовместимости (MHC) определяется положительная реакция.

Множество исследований посвящены децеллюляризации трипсином. Практически во всех работах авторы сообщают о массивной деструкции коллагеновых и эластиновых компонентов ЭЦМ. Из-за этого определяется ранняя кальцификация, и снижается  длительность «службы» клапана. Кроме того, трипсин негативно влияет на репопуляцию клапана клетками хозяина.

Деоксихолат натрия (SDC) — производное желчных кислот успешно применяется для децеллюляризации тканей с 2002 года.

Последнее десятилетие стало прорывом в области тканевой инженерии клапанов сердца. В 2000 году американская компания Cryolife начала выпускать децеллюляризированные свиные клапаны аорты под маркой «SynerGraft». Данные клапаны прошли успешные гидродинамические и иммунологические исследования и апробацию на овцах. Однако через несколько месяцев появились сообщения о плохом самочувствии детей, которым был имплантирован данный клапан. Через 2 года вышла статья с анализом ситуации. В ней сообщалось, что 1 пациент семи лет умер через 7 суток после операции, 1 девятилетний пациент умер спустя 6 месяцев после операции, еще 1 ребенок умер через год. Причиной смерти послужили клапан-ассоциированные осложнения в виде разрывов створок, воспалительных изменений и стенозов. 1 ребенку потребовалась реоперация спустя 2 суток после первичной операции. На всех клапанах наблюдались воспалительные изменения, фиброз, инкапсуляции, перфорации и износ створок. Причины до конца не ясны, но, вероятно, виной всему послужил далекий от оптимального протокол децеллюляризации.

В 2005 F.D. Da Costa с соавторами сообщили об 11 успешно выполненных операциях Росса с использованием децеллюляризированных аллографтов, изготовленных по оригинальной технологии Autotissue, при этом летальных случаев не отмечалось, 1 пациент был реоперирован по поводу кровотечения.

В целом, положительные результаты клинического применения децеллюляризированных ксено- и аллографтов вселяют надежду на дальнейшее развитие данного направления в тканевой инженерии и совершенствование протоколов децеллюляризации клапанов сердца.